染料废水因其具有色度高、产量大、毒性强、生物降解困难等特点，成为工业废水处理的难点。目前，染料废水的处理方法有物理（吸附法、膜分离法等）、化学（氧化法、电化学法等）及生物方法（藻类降解、活性污泥法等），然而这些方法普遍存在成本高、能耗大、反应条件严苛及可能产生二次污染等问题。利用生物酶降解技术处理染料废水具有脱色率高、能耗低、产物无毒等优点，展现出良好的应用前景。

漆酶（苯二醇：氧化还原酶，EC1.10.3.2）是一种含铜的多酚氧化酶，存在于细菌、真菌、昆虫和植物中。按来源分为植物漆酶、动物漆酶和微生物漆酶，微生物漆酶又分为真菌漆酶和细菌漆酶。漆酶因具有催化底物范围广、效率高、无有害副产物等特点，使其在染料脱色、酚类物质降解及生物传感器等领域得到广泛应用。在染料废水处理方面，漆酶对300多种常用染料的试验表明，近70%的染料可被其氧化。但在处理过程中存在稳定性差、对pH和温度变化敏感且难以回收重复使用等问题，加之提取与纯化成本较高，限制了其实际的应用。固定化技术作为解决这些问题的有效手段，通过吸附、包埋或共价结合等方法将漆酶固定于载体，且固定化后对污染物的降解效率也得到提高。综述了漆酶的固定化方法及载体材料，重点探讨了固定化漆酶在染料废水处理领域的应用潜力。同时，分析了目前研究中存在的不足，为后续利用固定化漆酶处理染料废水的研究提供参考。

1、漆酶及其固定化技术

1.1 漆酶的结构与特性

漆酶是由细胞产生的一种酸性等电点单体蛋白，由500~550个氨基酸组成，并伴随不同程度的糖基化，分子质量变化范围为50~70ku。绝大多数漆酶的活性中心包含4个铜原子，分布在3类结合位点中，其中T1和T2位点各分布1个铜原子，T3位点分布2个铜原子，如图1所示。静息状态下，铜原子以Cu2+的形式存在，T1、T2位点的铜原子分别是顺磁性Ⅰ型、Ⅱ型Cu2+，Ⅲ型Cu2（+T3位点）是反磁性的双电子受体，依靠羟基进行相连。漆酶具有广泛的底物特异性，能高效催化降解多环芳烃、酚类化合物、染料等多种有机污染物。在其催化反应中，以分子氧作为最终电子受体，无需外加辅因子，不产生有毒副产物，展现出优异的催化活性与环境友好性。

1.2 漆酶固定化技术

固定化技术是通过物理或化学方法将游离态酶固定在特定空间内或与其他物质构成的载体中，增加漆酶的稳定性和重复利用性。漆酶固定化方法及其优缺点如表1所示。

1.2.1 吸附法

根据结合力的不同，吸附法分为物理吸附法和离子吸附法。物理吸附法是依靠氢键、疏水作用和范德华力等相互作用使酶吸附到不溶于水的载体表面，不会破坏酶的天然构象，具有工艺简单、适用范围广、条件温和、对酶结构影响小等优点。常用载体包括高岭石、硅藻土、活性炭、纤维素及多孔玻璃等。XiaofengWEN等将高岭石作为载体固定化漆酶，漆酶负载量为12.25mg/g，酶活性达到839.01U/g。漆酶固定化后其重复利用性也会提高。例如，利用改性ZSM-5分子筛固定化漆酶，循环使用10次后仍保持初始酶活性的69.2%。

离子吸附法是依靠漆酶与具有离子交换基团的非水溶性载体之间的静电作用实现固定化。常用载体主要是阴阳离子交换剂。例如，T.BRUGNARI等将漆酶固定在单氨基乙基-n-氨基乙基-琼脂糖上，在pH为8.0条件下可显著提升漆酶的稳定性，储存40d后仍可保留约80%的活性。还有研究者将漆酶固定在铜（Ⅱ）或锰（Ⅱ）离子螯合磁性Fe3O4@CTS微球上，漆酶负载量约为100mg/g，在55℃、储存14d或重复使用5次后，均能保留约60%的酶活性，表现出优良的稳定性和重复使用性能。然而由于吸附法主要依赖物理或静电作用固定酶分子，导致结合力较弱，易出现酶脱落现象，固定化效率随使用次数逐渐下降。

1.2.2 包埋法

包埋法依据载体材料及结构差异分为凝胶包埋法及微囊包埋法。凝胶包埋法是将漆酶包裹在凝胶的三维网络结构中，能有效提升其稳定性和重复使用性。常用载体有藻酸盐、琼脂糖、聚丙烯酰胺等。其载体通过引入如羧甲基纤维素钠、膨润土等功能性组分构建复合凝胶，可显著提升漆酶对pH及温度变化的适应性，并改善其重复利用能力。例如，采用海藻酸钠-羧甲基纤维素钠包埋漆酶，在重复使用5次后保持50%以上活性；利用膨润土掺杂的海藻酸铜凝胶可使酶在适宜条件下相对活性达到100%。但当凝胶结构致密或孔径过小时会使底物扩散受限，传质阻力增加，导致酶活性降低并影响其重复使用性。

微囊包埋法是一种通过物理或化学手段将酶封闭于具有半透膜特性的结构中（如中空纤维或微胶囊）以实现稳定化的固定化技术。常用载体有壳聚糖、明胶及聚乙烯醇等。其材料可通过逐层自组装（LbL）技术和乳液静电纺丝等技术制备，形成结构致密和稳定的微囊载体。研究表明，基于海藻酸盐/壳聚糖及聚苯乙烯磺酸盐构建的微囊结构可有效提高漆酶的pH适应性与热稳定性，固定化漆酶活性分别达到9.38、70.22U/mg，包埋率为（61.57±1.37）%、（54.04±6.69）%，体现出良好的活性保持能力。总体来看，微囊包埋法在保护酶活性、提升稳定性方面具有显著优势，但由于结构相对致密，传质效率较低，且制备过程复杂，固定化效率相较于其他方法仍存在一定劣势。

1.2.3 共价结合法

共价结合法是指漆酶中的功能基团（如氨基、羧基、酪氨酸和组氨酸的芳香环）与载体上的有机基团通过共价键结合。常见方法包括硅烷化、醛亚胺缩合、溴化氢活化和重氮化。共价键的引入可显著增强酶与载体之间的结合强度，有效避免酶在使用过程中从载体上脱落的风险。例如，采用经硅烷化改性的碳纳米管并掺杂聚砜膜构建的载体固定化漆酶，其固定化效率高达96%，同时展现出优异的酶负载率。然而，该方法也存在潜在缺陷，如共价键形成过程中可能导致漆酶空间构象发生变化，从而影响其催化活性。

1.2.4 交联法

交联法是通过双功能交联剂在酶与载体间形成共价键连接，构建稳定的三维交联网架结构实现漆酶固定化。交联剂包括戊二醛、己二胺、二醛淀粉等，其中戊二醛应用最为广泛。研究表明，该方法可有效提升漆酶稳定性和循环使用性。S.ASLAM等利用壳聚糖珠固定化漆酶，酶活性达401.01U/mL，固定化效率为79%，8次循环使用后保持54.21%的初始活性。然而，交联剂在反应过程中可能与酶分子表面的氨基发生非特异性反应，引起酶分子构象变化，导致漆酶活性损失较快。例如，DajunREN等将漆酶固定在有机肥上，0.5h内相对酶活保持在100%，2.5h后降至72%~76%。同时单纯交联得到的酶网络体力学性能有限，因此，许多研究将该方法与包埋或吸附法联用，进一步优化固定化效果。

1.2.5 两者结合法

新型固定化载体与技术的不断发展为漆酶固定化提供了更多选择，但单一方法可能难以满足工业化大规模应用的需求，促使多种固定化策略结合应运而生，如吸附-包埋、吸附-交联及交联-包埋等。研究表明，复合固定化不仅显著提升了漆酶的负载量和活性保持率，还增强了酶的pH及热稳定性。例如，张思敏等采用吸附-包埋法将海藻酸钠、活性炭作为载体固定化漆酶，在3h内保留了76.31%的初始活性，且在4℃条件下储存30d后仍保持51.41%的相对活性。近年来，也有研究者利用三者结合来固定化漆酶。例如，YaoyuYANG等基于吸附-交联-共价结合方法制备的氨基修饰的磁性松木生物炭固定化漆酶，负载量高达782mg/g，重复使用10次后其活性保持在48.5%，在4℃保存30d后仍保持80.8%的活性。综上表明，多重固定化方法能兼顾高负载与稳定性的优势，未来应在保留复合体系优势的同时控制其成本。

2、漆酶固定化载体材料

载体的选择对于漆酶固定化至关重要，不仅直接关系到漆酶固定化的效果，还深刻影响着固定化漆酶在实际应用中的性能表现。目前载体材料可分为传统材料和新型材料两大类。

2.1 传统材料

2.1.1 天然高分子材料

天然高分子材料包括壳聚糖、海藻酸钠、细菌纤维素和明胶等，因其来源丰富、成本低、可生物降解且对酶具有良好亲和性，被广泛用于酶固定化。其中，壳聚糖因富含氨基基团可与漆酶表面的羧基形成稳定的酰胺键，增强酶与载体间的结合稳定性，可以实现高效固定与活性保持。例如，以包埋法将漆酶固定于壳聚糖球中，可达100%负载效率和98%固定化效率，储存30d后酶活性仍保留约80%。细菌纤维素因具备三维多孔网络结构和亲水性，为酶提供了丰富的结合位点和扩散通道，在偏酸条件下用于染料废水处理时，脱色率可达95.2%。由此可见，天然高分子材料在提升漆酶固定效率与稳定性方面具有明显优势，也为其在染料处理等实际应用中提供了良好基础。

2.1.2 合成高分子材料

相比天然高分子材料，合成高分子材料具有更优的结构刚性、力学强度和化学可调控性，能在固定化过程中更有效地保护漆酶活性，提升其重复使用和储存性能。常用材料包括树脂、聚丙烯酰胺、聚乙烯醇（PVA）和聚氨酯等。例如，有研究者通过接枝引入聚甲基丙烯酸缩水甘油酯改性的聚偏氟乙烯膜固定化漆酶，在循环使用10次后仍保持超过80%的催化活性。同时，功能基团改性的合成聚合物进一步提升了漆酶的稳定性。例如，武丁胜等利用静电纺丝和偕胺肟化改性，制备偕胺肟聚丙烯腈纳米纤维膜固定化漆酶，结果显示固定化漆酶在4℃条件下保存20d、重复使用10次后仍保持60%以上的活性。

2.1.3 无机材料

无机材料因具有化学稳定性好、降解效率高、成本低廉、使用寿命长等特点，被广泛应用于酶固定化领域。常见材料包括二氧化硅、硅藻土、膨润土、钛氧化物、活性炭及玻璃微珠等。为增强酶与载体之间的结合力，常通过氨基修饰等表面功能化手段提升其稳定性与固定化效率。例如，利用3-氨基丙基三乙氧基硅烷改性的废硅藻土固定化漆酶，其稳定性显著优于游离态漆酶。类似地，张育淇等将漆酶固定于氨基修饰的SiO₂大孔材料上，酶活性可达114U/g，且循环10次后活性仍保持70.8%，显示出良好的重复使用性能。

2.2 新型材料

新型材料包括碳纳米、金属纳米、磁性纳米、金属有机框架（MOFs）及介孔材料，具有比表面积高、孔隙结构丰富及优异的导电性和磁响应特性，不仅能显著提高酶的负载量和稳定性，还便于实现固定化酶的高效回收与重复利用。

2.2.1 碳纳米材料

碳纳米材料因其高比表面积、优异的化学稳定性、机械强度及良好的生物相容性，被广泛用于漆酶的固定化载体研究。常见的碳纳米材料包括碳纳米管（CNTs）、氧化石墨烯（GO）、碳纳米片、富勒烯等。例如，王旺民等采用包埋法将漆酶固定于CNTs上，其稳定性显著高于游离态漆酶，在贮存120h后，其酶活性保持在94.54%，经5次循环使用后，保持超50%的活性。

为进一步提升固定化性能，碳纳米材料常与其他有机或无机材料复合使用。如将多壁碳纳米管（MWCNTs）接枝于聚偏氟乙烯膜，不仅提升载体结构强度，还实现了30.40mg/cm2的漆酶负载量及4.47U/cm2的酶活性。此外，GO因生产成本低，表面富含氧化基团，便于功能化修饰也成为研究热点。例如，YingyingHUANG等利用几丁质和GO复合气凝胶珠固定化漆酶，对酸性大红（GR）进行5次循环脱色，均保持100%脱色率，表现出良好的稳定性与重复使用性。总体而言，碳纳米材料具备优异的酶载体性能，且通过复合改性可进一步增强其负载能力、稳定性与催化活性。

2.2.2 金属纳米材料

金属纳米材料作为纳米材料的一个重要分支，运用较多的金属粒子有Au、Cu、Zn及Ti等。相较于传统载体，金属纳米粒子更易与酶分子发生界面相互作用，在提升酶活性与环境适应性方面表现出显著优势。SijieGUO等将漆酶固定在Au纳米粒子表面，使其活性相比游离态漆酶提高91.2%。然而Au纳米粒子的局部表面等离子体共振效应易引发构象变化，从而影响长期催化效率。相比之下，铜纳米粒子因其良好的导电性和生物相容性，显示出更大的应用潜力。将纳米铜掺入聚丙烯腈/聚偏氟乙烯电纺丝纤维膜中固定化漆酶，不仅拓宽了酶的pH与温度适应范围，还显著提升了对染料污染物的去除效果。

2.2.3 磁性纳米材料

磁性纳米粒子通常由Fe、Mn、Co及其氧化物组成。其特点是能够提升漆酶的稳定性、活性及重复利用性，且超顺磁特性避免了粒子的磁性聚集，具有较好的经济可行性。其中，Fe3O4是目前应用最广泛的磁性材料之一。通过金属离子螯合、表面功能基团修饰等手段，可实现高效酶负载与稳定性提升。TingtingXIA等利用Cu2+螯合聚乙烯亚胺修饰的Fe3O4磁性纳米粒子固定化漆酶，负载量可达150mg/g，在循环使用中仍保持较高活性。

然而，磁性纳米粒子易发生团聚且表面活性位点有限，为改善其性能，常与天然高分子或无机材料形成复合载体。例如，将超顺磁性Fe3O4修饰于埃洛石纳米管上，并以壳聚糖功能化构建m-HNTS-CTA复合载体，其漆酶负载量达92.74mg/g，活性回收率高达92%，在稳定性和重复使用性能方面均优于单一组分载体。此外，磁性Fe₃O₄@SiO₂核壳结构凭借比表面积大、孔径可调节及易于修饰的表面特性广泛用于酶固定。通过引入聚酰胺-胺（PAMAM）等高功能密度树枝状聚合物，进一步提升其酶结合能力，漆酶负载量达到65.5mg/g。

2.2.4 金属有机框架

MOFs是一种由金属簇或无机金属离子与有机配体桥连而成的多孔材料，是典型的有机无机杂化纳米材料，具备比表面积大、孔道分布均匀、孔径可调节等优点。侯语桐等利用金属有机框架材料（ZIF-90）固定化漆酶，结果显示其酸碱、热稳定性均优于游离态漆酶，且未显著改变酶的构象，说明MOFs良好的孔道环境有助于保持酶的天然结构。同时，MOFs与高分子如PVA形成的复合体系可进一步增强材料的机械强度，循环使用6次后仍保持60%以上活性，显示出良好的重复利用能力。但利用MOFs固定化漆酶成本较高，制备工艺较为复杂。

2.2.5 介孔材料

介孔材料是一类孔径分布在2~50nm之间的多孔材料，具有较大的比表面积和孔容，能有效提高漆酶稳定性及活性。BoYANG等采用氨基修饰的介孔二氧化硅（SBA-15-NH2）作为载体，通过两步交联固定漆酶，其酶活性可达2977.5U/g，且在温度与pH变化条件下表现出更好的适应性，重复使用5次后仍保持56%的活性。除此之外，磁性介孔SiO2因兼具可磁性回收能力与良好的介孔结构，也被广泛用于酶固定化研究。例如，采用多层核壳磁性介孔材料Fe3O4@d-SiO2@p-SiO2固定化漆酶，在重复使用10次后酶活性仍保持在58.2%，显示出良好的重复使用性。

3、固定化漆酶处理染料废水的影响因素

3.1 固定化载体的特性

固定化载体的理化特性在很大程度上决定了固定化漆酶的性能，进而影响其对染料废水的脱色效果。较大的比表面积和孔容有助于提高酶负载量，增强底物扩散与转化效率，从而提升脱色能力。同时，适宜的孔径能够减少空间位阻，维持漆酶的天然构象，进而保持其催化活性。例如，张新宇等采用孔径与漆酶相匹配的高比表面积介孔MOF材料PCN-333（Al）固定化漆酶，不仅酶负载量高达688.9mg/g，且对活性艳蓝的降解率在200min内达89.0%，重复使用5次后仍保持78.5%的活性，展现出良好的稳定性与可重复使用性。此外，载体的亲疏水性也影响了其对不同类型染料的吸附选择性，亲水性载体更适用于富含—OH、—NH₂等极性基团的染料分子，而疏水性载体则更有利于非极性染料的富集。因此，合理选择和优化载体的结构与表面性质，是提升固定化漆酶脱色效率的关键之一。

3.2 温度

温度是影响固定化漆酶活性及其对染料废水去除效率的重要因素。低温使固定化漆酶的催化活性受到抑制，导致对染料废水的脱色效率显著降低。大多数固定化漆酶在30~50℃之间具有较高活性，处理染料废水效果较好。李雪萍等利用磁性MOF固定化漆酶，在20℃时酶活性仅为60%，而最适温度30℃时活性提至100%，对刚果红的降解效率也提至85%。高温可能引发漆酶热变性，造成酶活性不可逆损失而影响去除效果。A.M.OTHMAN等利用功能化多壁碳纳米管膜固定化漆酶在50℃时，对活性黑5降解率为75%，酶活性达88.13%；但经60℃热暴露4h后，酶活性降至78.95%，7h后完全失活，说明过高温度严重影响酶稳定性。因此，在脱色过程中需优化反应温度，在确保酶活性稳定的前提下实现高效脱色。

3.3 pH

pH也是影响固定化漆酶活性及染料去除效果的重要因素。大多数固定化漆酶在pH为4~6之间活性较高。A.AMARI等利用磁性氨基功能化MOF固定化漆酶处理活性黑5和茜素红染料废水，在pH为4时固定化漆酶活性达到100%，两种染料去除率分别为100%与80%，而在pH为2和7时，酶活性及脱色效果明显下降。黄新健等研究发现，固定化漆酶在pH为4.5时活性可达100%，但在pH为6时活性不足20%。这一现象表明，偏离固定化漆酶的最适pH，无论酸性过强或偏向中性，均可能引起酶构象变化，导致其催化活性下降，从而影响染料的去除效果。

3.4 接触时间

接触时间同样制约着固定化漆酶活性，其最优值受漆酶来源、载体类型等多重因素影响。通常，真菌漆酶大多催化活性强、底物适应性广，反应时间相对较短；细菌漆酶具有良好的稳定性，但其催化活性及底物适应性可能相对较弱，因此二者经固定化后处理染料的时间可能就不同；此外，载体结构与表面性质也影响酶固定效果及降解速率。何洋等以改性聚偏二氟乙烯膜固定漆酶处理橙黄Ⅰ，4h脱色率超60%，24h达到（97.2±1.4）%，此后随时间增加脱色率逐渐下降。朴云仙等利用海藻酸铜包埋漆酶处理亚甲基蓝，在5h内降解率达到100%，随后也出现下降趋势。这表明固定化漆酶在一定接触时间内对染料脱色的效果可达峰值，但超出该时间后效果下降。造成这种现象的原因可能一是降解产物不断积累，抑制了酶促降解反应，二是载体的吸附达到饱和，无法继续发挥作用，三是随着降解过程的持续，漆酶活性逐渐降低导致失活。

4、固定化漆酶在染料废水处理中的应用

染料分为天然染料和合成染料，其中合成染料使用量最大，按其化学结构可分为偶氮染料、蒽醌染料、杂环染料和三苯甲烷染料等。漆酶在处理这些染料时，通过催化氧化反应产生高度非特异性的自由基，破坏染料分子中的关键发色基团，从而实现脱色与降解。漆酶催化降解偶氮染料及蒽醌染料的作用机制如图2所示。

漆酶经固定化后，其稳定性、重复利用性及对染料的脱色效果均有显著提高。S.RAWAT等利用等离子体功能化的超顺磁性Fe₃O₄纳米颗粒固定漆酶，结果显示该固定化体系不仅具有优于游离酶的热稳定性和pH耐受性，且Fe₃O₄的磁性赋予其良好的可回收性。在处理偶氮染料酸性蓝193时，固定化漆酶在4h内的降解率超过95%，循环使用10次后，降解率仍保持在80%以上。固定化漆酶在染料废水处理中的应用如表2所示。固定化漆酶对染料废水去除效果的提升，除酶本身的催化作用外，载体的吸附作用也是一部分。研究表明，漆酶的固定化对载体的吸附性能影响不大，在初始阶段，载体对染料的物理吸附起关键作用，随着系统持续运行，载体吸附趋于饱和，此时酶促降解成为主要机制。漆酶在失活前，能持续促进水中污染物及附着在载体表面的污染物降解。

5、结论与展望

与传统染料废水处理方法相比，固定化漆酶技术具有反应条件温和、脱色效率高和环境友好等优势。相较于游离态漆酶，其在热稳定性、pH耐受性和重复使用等性能方面具有明显提升，显著增强了在复杂染料废水环境中的适应性与处理效果，并在一定程度上降低了酶的使用成本。然而，该技术在实际应用中仍面临一些挑战，未来研究应从以下几方面着手：

1）漆酶产量受限于提取与纯化过程，未来可通过筛选高产漆酶菌株、优化培养条件及适当添加诱导剂来提高漆酶产量与活性；同时改进漆酶的纯化技术，如采用透析、超滤、电泳、等电点沉淀等方法，提升纯化效率，从而有效降低总体成本。

2）漆酶固定化过程中，由于载体的存在使得底物扩散受阻，可能导致酶活性降低。未来应优化载体材料及固定化工艺，以最大限度保持或提升酶的活性。同时，也可通过基因工程技术，如定点突变或基因重组，从酶本身出发对其结构进行优化，提升其在固定化状态下的活性与稳定性。

3）固定化漆酶在碱性环境中活性受限，制约其在碱性染料废水处理中的应用。对此，可引入碱性稳定性强的酶源、开发适应碱性环境的载体系统或联合介体体系以促进电子传递效率，从而提升其在碱性环境中的催化性能和处理效果。