近年来，抗生素被广泛应用于医疗和畜牧业，根据2000年—2018年的研究，全球抗生素消耗量增长了46%，其中青霉素类、磺胺类和喹诺酮类等抗生素主要在发展中国家被广泛使用，2000年—2010年的使用量增长了36%。抗生素的滥用导致细菌产生耐药性，加剧了抗性基因（ARGs）在生态环境中的传播，对公众健康构成威胁。硝化污泥系统可以通过氨氧化微生物的共代谢作用有效去除多种药理活性化合物（PhACs），包括抗生素、雌激素、阿替洛尔等。氨氧化微生物以氨氧化细菌（AOB）为主，其分泌的一种非特异性酶（氨单加氧酶），可以将氨氧化成羟胺的同时有效降解抗生素。但是抗生素废水的条件经常发生波动，比如盐度、pH、温度等，而硝化污泥系统对抗生素的降解效果易受到这些因素的影响，进而影响ARGs的丰度。目前，在硝化污泥系统去除抗生素的过程中，关于盐度对ARGs影响的研究较少。为此，笔者以一种广泛使用的磺胺类抗生素磺胺嘧啶（SDZ）为研究对象，探究盐度对硝化污泥系统去除抗生素效能的影响，并分析不同盐度下系统中ARGs丰度以及微生物群落结构的变化。

1、材料与方法

1.1 试验材料

试验接种污泥取自济南光大水务小清河污水处理厂二沉池中的回流污泥。试验进水采用模拟废水，SDZ浓度为5.0mg/L，其他组分如下：氯化铵为191mg/L、磷酸氢二钾为58mg/L、磷酸二氢钾为24mg/L、二水合氯化钙为67mg/L、结晶硫酸镁为42mg/L、碳酸氢钠为1000mg/L。废水中加入微量元素溶液，以保证微生物正常生长，其组分如下：氯化铁为1500mg/L、硼酸为150mg/L、五水合硫酸铜为30mg/L、碘化钾为30mg/L、四水合氯化锰为120mg/L、二水合钼酸钠为60mg/L、七水合硫酸锌为120mg/L、六水合氯化钴为150mg/L。

1.2 试验方法

1.2.1 污泥驯化

由于接种污泥中硝化细菌的含量和活性均较低，因此，试验开始时需要对其进行驯化，驯化总周期为30d。试验装置如图1所示，采用圆柱形SBR反应器，有效容积为4L，体积交换比为1∶1。反应器为全自动运行，每个运行周期为6h，其中进水30min、曝气270min、污泥沉降30min、出水10min、静置20min，每天运行4个周期。

试验采用好氧曝气，并采取连续增加进水负荷的方法来驯化污泥，最终使得进水氨氮浓度控制在50mg/L。驯化过程中需要对反应器进行定期排泥，以保证污泥浓度基本维持在4000mg/L。当系统出水水质稳定、NH4+-N基本被完全去除且无NO2--N积累时，表明硝化污泥驯化完成。

1.2.2 硝化污泥系统性能研究

试验设置4组平行的SBR反应器（S1~S4），将驯化完成后的污泥放至反应器中，并控制每个反应器的污泥浓度在4000mg/L左右。反应器的运行参数与污泥驯化阶段一致。通过控制NaCl的添加量使反应器S1~S4的进水盐度分别为0、0.5%、1.0%、2.0%，反应器运行30d，分别在第1、5、10、15、20、25、30天测定出水NH4+-N、NO3--N、NO2--N以及SDZ浓度，考察不同盐度下系统的硝化效果以及对SDZ的去除效果。其中，NH4+-N、NO3--N、NO2--N浓度均采用国家标准方法进行测定，SDZ浓度采用高效液相色谱仪进行测定。

1.2.3 amoA、ARGs和微生物群落分析

已有研究证实，在氨存在的情况下，AOB的共代谢降解是去除SDZ的主要机制，亚硝酸盐氧化菌（NOB）的贡献很小。amoA基因的表达量可以作为AOB活性的生物标志物，水平基因转移（HGT）和微生物群落是影响ARGs丰度的两个重要因素，因此在试验运行30d后提取不同盐度反应器的污泥样本DNA进行q-PCR检测，探究每个阶段污泥中amoA基因、整合子基因（intI1，水平转移的指示性基因）、ARGs（sul1、sul2）和细菌的16SrRNA基因丰度的变化情况，并分析不同盐度条件下硝化污泥系统中微生物群落结构的变化。同时对ARGs、intI1和微生物群落丰度进行了Pearson相关性分析，确定ARGs丰度的变化机制。其中宿主菌的识别依据是相关性的显著性系数（p值），当p<0.05时为显著相关，即认为该菌是ARGs的宿主菌。相关性分析由SPSS软件完成，微生物群落与ARGs的相关性热图由Origin软件完成。

2、结果与讨论

2.1 SDZ的去除

不同盐度条件下硝化污泥系统对SDZ的去除效果如图2所示。在无盐度条件下，在生物降解的最初10d，反应器对SDZ的去除率呈升高趋势，并在第10天达到最佳去除效果，而后趋于稳定（平均去除率为93.37%），这种现象与硝化污泥对抗生素的适应性有关。随着进水盐度的增加，硝化污泥系统对SDZ的去除率逐渐降低。当进水盐度分别为0.5%、1.0%和2.0%时，第10天时对SDZ的去除率分别为94.3%、71.2%和42.3%。此外，盐度由0.5%增加到2.0%时，出水SDZ浓度由0.276mg/L增加到2.804mg/L。该结果表明，长期暴露在盐度冲击负荷环境下，硝化污泥对抗生素的生物降解能力受到影响，降解能力随着盐度的增加而逐渐降低，这也说明在高盐度下微生物活性较低。

2.2 盐度对硝化污泥系统性能的影响

不同盐度下硝化污泥系统的性能如图3所示。

在未添加NaCl的反应器S1中，NH4+-N能够被快速去除，平均去除率可达99%。当盐度由0.5%增加到1.0%时，NH4+-N的平均去除率稍微降低（由98.97%降至82.06%），而当盐度增加到2.0%时，NH4+-N的平均去除率急剧下降，仅为54.88%。该结果表明高盐度对反应器的硝化性能有显著影响，这是由于AOB对盐度敏感，在高盐环境中生长缓慢，氨氧化活性被抑制，从而导致NH4+-N去除率降低。

在未添加NaCl的反应器S1中，大部分NH4+-N转化为NO3--N（平均浓度为48.63mg/L），几乎没有出现NO2--N的积累，说明系统硝化性能良好。而当进水盐度为1.0%和2.0%时，NO2--N浓度有所升高，NO3--N浓度降低，尤其是当盐度为2.0%时，NO2--N平均浓度增至3.63mg/L，而NO3--N平均浓度仅为26.09mg/L，这是由于在此盐度下AOB和NOB活性均受到一定程度的抑制。综上所述，在较低盐度（0.5%）条件下硝化污泥系统的硝化性能较好，但是当盐度升高时（1.0%和2.0%），系统的硝化性能会受到不同程度的抑制。

2.3 盐度对硝化污泥系统中微生物群落的影响

2.3.1 amoA基因的相对表达

amoA基因的表达受到了盐度冲击的影响。amoA基因的丰度在未投加NaCl的初始污泥中最高，为6.45×10-6copies（以16SrRNA为标准，下同）。投加NaCl之后，amoA基因的丰度随着盐度的增加而逐渐降低，当盐度增至2.0%时其丰度最低，为2.42×10-6copies。这表明盐度对硝化污泥系统中amoA基因的表达具有显著的抑制作用，盐度冲击负荷越大，系统内AOB活性受到的抑制作用也越大，这与高盐度下NH4+-N去除率下降的结果一致。

2.3.2 属水平上的菌群变化

运行30d后，不同盐度下硝化污泥系统中微生物菌群在属水平上的分布情况如图4所示。

从图4可以看出，随着进水盐度的增加，相对丰度排名前30之外的其他菌种丰度逐渐升高，说明盐度的冲击降低了物种分布的均匀程度。在硝化污泥系统中，AOB和异养菌均参与抗生素的去除过程。Nitrospiraceae作为常见的AOB，它所分泌的氨单加氧酶可以共代谢降解多种抗生素。图4显示，unidentified_Nitrospiraceae的相对丰度随盐度的升高而逐渐降低，这与amoA基因的表达变化一致。除了AOB，多种异养菌也被检测到，如动胶菌属（Zoogloea）、氢噬胞菌属（Hydrogenophaga）和陶厄氏菌属（Thauera）等。其中，Zoogloea、Hydrogenophaga均具有降解有机物和有毒物质的能力，Thauera具有降解芳香族污染物的能力，因此它们对磺胺嘧啶也具有一定的生物降解作用。另外发现，Zoogloea、Hydrogenophaga和Thauera的相对丰度在盐度为2.0%时大幅降低，这是由于高盐度会显著影响细菌的细胞结构和生理功能，并在一定程度上抑制其活性。综上，高盐度抑制了抗生素降解菌的活性，进而导致抗生素去除率降低。

2.4 盐度冲击下ARGs的变化

在硝化污泥系统中，ARGs的传播机制仍不明确，盐度对ARGs的影响也有待研究。因此，本研究通过4个SBR反应器研究了不同盐度条件下ARGs的丰度，结果如图5所示。添加NaCl后，sul1和sul2的丰度随着盐度的提高而逐渐降低，但均比无盐度条件下要高，其中，当盐度为0.5%时，各基因的丰度均达到最大值，sul1和sul2的丰度分别为3.79×10-4、2.97×10-4copies，这表明低盐度的冲击促进了ARGs的增殖。

为了进一步确定ARGs的变化机制，对intI1、sul1和sul2进行相关性分析，结果显示，sul1、sul2与intI1基因显著相关，表明水平基因转移促进了ARGs的传播。另外，对微生物群落和sul1、sul2进行了相关性分析，结果如图6所示（“*”表示在p<0.05水平上相关性显著）。可知，Plasticicumulans、Sulfuritalea和Brevumdimonas是sul1和sul2的宿主菌。因此，水平转移和微生物群落结构变化均会导致ARGs的变化，即0.5%盐度条件下较高的sul1、sul2丰度一方面是由水平基因转移（较高的intI1丰度）导致；另一方面，Plasticicumulans、Sulfuritalea以及Brevumdimonas在0.5%盐度下较高的丰度也使得sul1和sul2丰度升高。

3、结论

①无盐度时硝化污泥能够高效去除SDZ，平均去除率可达93.37%，而高盐度会抑制抗生素降解菌的活性，进而导致抗生素去除率降低。

②较低盐度（0.5%）时硝化污泥系统的脱氮性能较好，NH4+-N去除率高达99%。但是当盐度升高（1.0%和2.0%）时，AOB和NOB活性受到抑制，系统的硝化效果降低。

③NaCl的投加促进了ARGs的增殖，在较低盐度（0.5%）时ARGs丰度最高，这是水平基因转移和微生物群落变化共同作用的结果。