由于部分城镇地区的污水收集管网不完善，导致污水处理厂进水C/N较低，不能有效实现生物脱氮。因此，污水处理厂常采用外加碳源的方式来满足微生物代谢需求，常用碳源包括甲醇、乙酸、乙醇和葡萄糖等，但均存在运行成本高、资源浪费等问题。此外，有研究利用活性污泥发酵液、柠檬酸生产废水的浓缩液、蓝藻发酵液等高浓度有机废水作为碳源，取得了一定的脱氮效果。Fu等认为利用某些高浓度工业废水作为碳源，具有资源利用率高、生物降解性好的优势。

高浓度白酒酿酒废水的COD较高，富含小分子醇类、酸类和醛类等物质，可生化性好，是一种优质的反硝化碳源。笔者采用高浓度白酒酿酒废水作为液体碳源，构建反硝化生物处理系统，并研究容积负荷、溶解氧和停曝比对脱氮效能的影响，进一步通过三维荧光光谱、扫描电子显微镜和宏基因组分析系统的微生物作用机理，旨在为酿酒废水的资源化利用和低C/N生活污水处理提供技术支撑，实现“以废治废”。

1、材料与方法

1.1 实验材料

采用移动床生物膜反应器（MBBR）接种污水处理厂浓缩池污泥，通过混合废水（COD=350mg/L、NH4+-N=37.5mg/L、TN=40mg/L、TP=4mg/L）培养3d，待系统挂膜完成后开始处理污水。进水采用人工模拟低C/N生活污水（COD=65mg/L、NH4+-N=35mg/L、TN=35mg/L、TP=2mg/L），加入白酒酿酒废水（COD=270000mg/L、NH4+-N=2500mg/L、TN=6500mg/L、TP=2400mg/L）作为碳源，并添加微生物所需营养物质：CoCl2·6H2O=0.15mg/L、FeSO4·7H2O=0.3mg/L、Na2MoO4·2H2O=0.06mg/L、CuSO4·5H2O=0.06mg/L、MnCl2·4H2O=0.12mg/L、H3BO3=0.15mg/L、KI=0.15mg/L、ZnSO4·7H2O=0.12mg/L、Na2WO4·2H2O=0.06mg/L、NiCl2·6H2O=0.15mg/L。

第一阶段，控制溶解氧浓度为5～6mg/L，反应器内温度为（30±1）℃，采用间歇式运行方式（23.5h反应+0.5h换水），通过单因素实验研究容积负荷对系统脱氮效能的影响；第二阶段，在最佳容积负荷条件下，通过单因素实验研究溶解氧浓度对系统脱氮效能的影响；第三阶段，在最佳容积负荷和最佳溶解氧浓度条件下，研究停曝比对系统脱氮效能的影响。

1.2 实验方法

1.2.1 水质理化指标测定

NH4+-N采用纳氏试剂分光光度法测定，TN采用碱性过硫酸钾消解紫外分光光度法测定，TP采用钼酸铵分光光度法测定，COD采用快速消解分光光度法测定，pH和DO采用HACH便携式多参数数字化分析仪测定。

1.2.2 三维荧光光谱分析

三维荧光光谱采用荧光光谱仪测定，激发光源为150W氙灯，固定激发波长狭缝为5nm，扫描速度为12000nm/min，激发波长λEx=250~800nm，发射波长λEm=250~800nm，光电倍增管（PMT）电压为700V，响应时间为自动。

将所测得的光谱图案按特定激发、发射波长划分为7个区域，各区域位置及其所代表的荧光物质如表1所示。

1.2.3 扫描电子显微镜分析

采集最佳反应条件下反应器中的生物膜，参考李彦澄等的实验方法对生物膜进行离心、固定、清洗、脱水、置换、镀金处理后，采用扫描电子显微镜观察并拍照。

1.2.4 宏基因组分析

采集反应器中的生物膜保存于无菌EP管，并立即置于-80℃超低温冰箱内冷冻保存，然后在冷冻条件下送至上海某生物公司进行宏基因组测序，主要流程为：使用FastDNASpinKitForSoil试剂盒抽提样品DNA，采用1%琼脂糖凝胶电泳检测抽提的基因组DNA完整性，采用基因组剪切仪对检测合格后的DNA片段进行剪切，打断为约400bp的片段，构建PE文库后进行桥式PCR扩增和Illumina测序。最后利用宏基因组云平台对得到的原始数据进行分析，包括物种种类、功能丰度和代谢通路分析等。

2、结果与讨论

2.1 污染物去除效能

当容积负荷分别为0.044、0.067、0.089和0.111kgCOD/（m3·d）时，对应进、出水污染物平均浓度及去除率如图1（a）所示。在不同容积负荷条件下，NH4+-N去除率均高于90%；当容积负荷为0.111kgCOD/（m3·d）时，TN和COD的去除率均最高，说明该系统的最佳容积负荷为0.111kgCOD/（m3·d）。

在系统容积负荷为0.111kgCOD/（m3·d）的条件下，溶解氧分别控制为1~2、2~3、3~4、4~5mg/L，结果如图1（b）所示。在不同溶解氧条件下，系统对COD和NH4+-N的去除率均高于90%，且不随溶解氧浓度的变化而出现较大波动，但TN去除率随溶解氧浓度的增加而降低。当溶解氧为1~2mg/L时，TN去除效果最好，说明该系统的最佳溶解氧为1~2mg/L，在该条件下，系统同时具有较好的硝化与反硝化效能。

在容积负荷为0.111kgCOD/（m3·d）、溶解氧为1~2mg/L的条件下，采用间歇曝气方式，控制停曝比分别为4∶1、3∶1、2∶1和1∶1，结果如图1（c）所示。在不同停曝比条件下，系统对COD的去除率均为94%左右；NH4+-N去除率随停曝比的减小呈升高趋势，当停曝比为1∶1时，NH4+-N去除率高达（90.9±2.7）%；但TN去除率随停曝比的减小呈先升高后降低的趋势，在停曝比为3∶1时，TN去除率最高，说明系统的最佳停曝比为3∶1。

2.2 溶解性有机物分析

通过三维荧光光谱分析系统进、出水溶解性有机物的变化，了解微生物对其利用情况。采集最佳控制条件下的系统进、出水进行三维荧光光谱分析，结果如图2所示。进水均在Ⅲ区检测到荧光峰，且荧光强度最高，在Ⅱ、Ⅳ和Ⅵ区也出现一定强度的荧光带，说明进水主要为类溶解性微生物代谢产物，也有一定浓度的类色氨酸蛋白质物质、类富里酸物质、类黑精物和类木质纤维素物质。出水荧光谱图中Ⅲ区的荧光强度明显减弱，荧光峰明显降低甚至消失，说明酿酒废水中的类溶解性微生物代谢产物被系统中微生物较好地利用。此外，出水在Ⅱ、Ⅳ和Ⅵ区检测到的荧光强度均有所降低，说明出水中类色氨酸蛋白质物质、类富里酸物质、类黑精物和类木质纤维素物质在一定程度上被系统中的微生物降解。

2.3 微生物形态分析

通过扫描电子显微镜观察最佳控制条件下反应器中的生物膜形态，结果如图3所示。可知，系统中的微生物主要呈球状、杆状、丝状和螺旋状，这与Fan等研究中观察到的微生物形态类似。好氧生物膜的微生物通常呈丝状、杆状和球状，这些细菌参与同步硝化反硝化过程。丝状菌在生物膜骨架中能为微生物附着提供有利环境，聚集更多微生物；球状菌为NO2--N的积累提供了可能；杆状菌可作为NH4+-N氧化的交换通道。此外，硝化菌和反硝化菌多为杆状菌，如硝化杆菌、芽孢杆菌等。因此，合理控制容积负荷和溶解氧浓度有利于系统中微生物发生同步硝化反硝化作用，这主要是因为适量的碳源能为微生物提供电子供体，而在适宜的溶解氧浓度下，生物膜外层好氧区的微生物能较好地实现硝化作用，内层缺氧区则有利于微生物进行反硝化。

2.4 宏基因组分析

选取接种污泥（S0）、最佳容积负荷（S1）、最佳溶解氧浓度（S2）和最佳停曝比（S3）阶段的微生物样本进行宏基因组分析，各样本序列的组装拼接结果统计如表2所示（序列数分别为743040、598680、563910、577205）。

由表2可知，在4组样本中，S0的序列数和总序列长度均高于S1~S3，说明经混合废水培养后，系统的微生物物种数量减少。N50和N90分别为组装序列的累加值第一次超过所有序列总长度的50%和90%时所扫描到的序列长度，在4组样本中，S2的N50和N90最大。4组样本的最短序列长度均为300bp，而所含序列最长的样本为S1。

属水平上的物种丰度对比见图4（a）。S0的优势属分别为unclassified_c__Actinobacteria（4.97%）、unclassified_p__Chloroflexi（4.81%）、unclassified_c__Anaerolineae（4.60%）、unclassified_p__Bacteroidetes（4.55%）、小念珠菌属、硝化螺菌属。S1的优势属分别为微白霜菌属、丙酸菌属、unclassified_c__Deltaproteobacteria（4.12%）、中村氏菌属、unclassified_p__Acidobacteria（2.66%）。S2的优势属分别为Micropruina（14.46%）、Propionibacterium（9.82%）、unclassified_p__Chloroflexi（3.87%）、unclassified_c__Deltaproteobacteria（2.74%）、Nakamurella（2.74%）。S3的优势属分别为Micropruina（26.22%）、Propionibacterium（13.83%）、Nakamurella（2.97%）、unclassified_p__Actinobacteria（2.89%）、unclassified_p__Chloroflexi（1.60%）。与接种污泥相比，系统中丰度变化较大的菌属分别为Micropruina、Propionibacterium、Nakamurella，说明经混合废水培养后优势属发生变化。Nakamurella作为硝化菌属，在生物脱氮中起着关键作用；Micropruina能促进有机物的降解以及氮的去除；Propionibacterium作为去除有机物的功能菌属，能以乳酸作为碳源，在微好氧条件下生长，而高浓度白酒酿酒废水中富含高浓度的有机酸类物质。同时，Nakamurella和Micropruina能在细胞内储存大量的糖类聚合物，可以发酵白酒酿酒废水中由谷物产生的大量氨基酸和糖类，这可能与有机物的去除有关。S1～S3中的unclassified_p_Chloroflexi较S0有所降低，这可能与TN、NH4+-N被去除有关。种水平上的物种丰度见图4（b）。丰度变化较大的菌种为Micropruina_glycogenica、Propionibacterium_sp.、Actinobacteria_bacterium、Nakamurella_multipartita、Anaerolineae_bacterium。在最优控制条件下，均出现优势种Micropruina_glycogenica，这是因为该菌株为典型的聚糖菌，可在缺氧条件下将硝酸盐还原为亚硝酸盐，在脱氮过程中起着重要作用。此外，相关研究发现，Actinobacteria_bacterium和Anaerolineae_bacterium中存在与氮循环相关的功能基因，具有生物脱氮功能。Nakamurella_multipartita能在细胞中积累大量多糖，常存在于含糖废水中，因此当添加酿酒废水后，S1~S3均出现了Nakamurella_multipartita。

基于KEGG数据库对微生物功能进行注释，结果如图5所示。4组微生物样本的碳代谢过程均注释到6种功能，其中代谢功能占主导地位，其次是人类疾病、环境信息处理、组织系统、细胞过程、遗传信息处理；氮代谢过程均注释到4种功能，其中代谢功能占主导地位，其次是环境信息处理、细胞过程、组织系统。碳代谢和氮代谢过程中参与代谢功能的微生物丰度最大，且均呈现S0整体丰度最小、S3整体丰度最大的现象。

进一步分析碳代谢和氮代谢的完整路径，发现4组样本中存在47条与碳代谢相关的完整路径，包括碳水化合物代谢（21条）、能量代谢（24条）、甲烷代谢（2条）。在碳代谢过程中丰度较高的分别为：三羧酸（TCA）循环、Arnon-Buchanan循环、Embden-Meyerhof途径、第二次碳氧化。4组微生物样本中与氮代谢相关的完整路径有6条，包括反硝化作用、异化硝酸盐还原、完全硝化、硝酸盐同化作用、固氮作用、硝化作用，其中反硝化作用占主导地位。

3、结论

采用高浓度白酒酿酒废水作为反硝化液体碳源，当容积负荷为0.111kgCOD/（m3·d）、溶解氧浓度为1~2mg/L、停曝比为3∶1时，系统的脱氮效率最高。通过三维荧光光谱分析发现，系统对类溶解性微生物代谢产物的去除效果较为明显，对类色氨酸蛋白质物质、类富里酸物质、类黑精物和类木质纤维素物质等有一定的降解。采用扫描电子显微镜发现，微生物主要为球状、杆状、丝状和螺旋状。通过宏基因组分析发现，系统中的优势属为Micropruina、Propionibacterium、Nakamurella。基于KEGG数据库功能注释结果显示，代谢功能占主导地位，系统中与氮代谢相关的完整路径有6条，其中以反硝化功能为主；与碳代谢相关的完整路径有47条，其中以TCA循环为主。