好氧颗粒污泥（AGS）是废水生物处理领域的一项新技术，是活性污泥絮体在一定条件下自凝聚，最终形成结构致密、形状规则的微生物聚合体。成熟的AGS呈球形或椭球形结构，颜色多为橙黄色、棕色、灰褐色。与传统的活性污泥相比，其具有良好的沉降性、较高的生物量和稳定的处理效能，因而极具发展潜质。

新疆是主要的番茄酱生产和加工基地，每年7月—10月中旬会产生大量的高浓度有机废水，此类废水超标排放会对环境造成危害。而处理番茄酱这类季节性的食品加工废水，需要提前驯化污泥以适应每年的生产季。已有科研人员对在SBR中采用AGS处理番茄酱生产废水的污泥颗粒化过程进行了分析，并积累了经验。另外，也有部分学者对AGS的储存与恢复性能进行了研究。高景峰等分析了AGS在不同储存方法条件下的恢复效果及影响。但AGS在长期冷冻储存后处理番茄酱废水的性能恢复及微生物演替情况研究仍存在空白。

笔者对冷冻储存260d左右的AGS进行恢复试验，探究污泥特性，并采用高通量测序技术表征恢复后的微生物群落，旨在寻求适应番茄酱生产周期的合理化废水处理方式，这对解决AGS长期驯化问题、与实际生产运用的对接和保护水资源具有现实意义。

1、材料与方法

1.1 试验装置和运行方式

SBR反应器由有机玻璃制成，其内径为8cm，高为100cm，有效容积为4L。反应器底部设有曝气装置，控制溶解氧（DO）在8mg/L左右，pH保持在7.0~7.5之间。一个运行周期为4h，每天运行6个周期，共进行130d。其中，进水10min、曝气200min、初始沉降时间为28min、出水2min。

1.2 接种污泥

试验接种污泥取自实验室采用配制番茄酱废水培养了185d的AGS，质量为200g，MLSS为5750mg/L，MLVSS为4830mg/L，MLVSS/MLSS为0.84，在-18℃环境下于清水瓶中恒温冷冻保存约260d。AGS外观呈浅褐色球形或椭球形，结构较为密实、光滑（见图1），颗粒粒径平均为8mm，最大可以达到11mm。

体视显微镜显示，部分颗粒的表面存在孔洞，是为颗粒内部传递营养物质和输送气体的通道。在长期的低温环境中储存后，细菌凋亡，活细菌逐渐减少，生物活性降低，一些颗粒发生了破裂。

1.3 试验水质

试验水质采用人工合成的番茄酱加工废水，以鲜榨番茄汁提供碳源，COD浓度为800~1400mg/L，NH4+-N、PO43--P分别由氯化铵（NH4Cl）和磷酸氢二钠（Na2HPO4）配制，浓度分别为50、10mg/L。采用无水碳酸钠（Na2CO3）调节pH。常量元素和微量元素的配制参照文献。

1.4 分析项目及方法

COD、NH4+-N、PO43--P、MLSS、MLVSS和污泥容积指数（SVI）等采用《水和废水监测分析方法》（第4版）测定，DO采用溶解氧仪测定。

高通量测序：取适量不同时期的颗粒污泥分别放入已灭菌的2mL离心管中进行提取，在0℃下保存。取4个时期的污泥样品，分别编号为D1（65d污泥）、D2（90d污泥）、D3（120d小颗粒污泥，粒径为0.45~2mm）、D4（120d大颗粒污泥，粒径为3~4mm）。DNA提取和PCR引物扩增均由生工生物工程（上海）股份有限公司完成，提取的具体过程参照E.Z.N.ATMMag-BindSoilDNAKit的基因组DNA提取试剂盒说明书。电泳条件为1%琼脂糖凝胶、1×TAE的电泳缓冲液、110V的电压、15min。扩增片段为16SrDNA的V3-V4，片段大小为400bp左右。PCR引物为341F（CCTACGGGNGGCWGCAG）和805R（GACTACHVGGGTATCTAATCC）。

2、结果与讨论

2.1 活性恢复过程中污泥的物理特性

图2为AGS活性恢复试验不同时期的照片。

从图2可以看出，培养第2天的AGS开始松散、解体，出现带状剥落层，出水浑浊，MLSS只有4330mg/L，MLVSS/MLSS为0.58。接种后第7天，MLSS达到5590mg/L，部分颗粒停止破裂，形态由松散向圆实转化，颗粒表面变得光滑莹润、颜色加深、颗粒增多、粒径缩小。到第13天时，MLSS降到4340mg/L，粒径在4mm以上的颗粒污泥占34.7%，小于0.45mm的达到22.3%。当第20天时，大颗粒污泥消失，基本为2~4mm的黄色扁平状小颗粒，部分空洞，平均沉降速度提高到66.47m/h，出水水质清澈。第35天再次发生变化，空洞的颗粒污泥解体消失，成长为密实的黄褐色椭球形污泥，粒径在0.45~1mm之间、由絮状污泥新生的小粒径污泥质量比过半，MLSS为5632mg/L。第100天时，粒径为0.45~2mm的新生颗粒占到68%，大于4mm的颗粒质量比不超过10%，MLSS稳定在8000mg/L左右。最终，第130天时，0.45~4mm的粒径占比超过75%，占主导地位。

分析原因，好氧颗粒污泥经过长期低温储存后，死菌和活菌相互分离从颗粒中脱落。起初2d，一部分胶体溶于水中，增加了悬浮物浓度，而另一部分则解体分散，以晶核形式重新颗粒化。到第7天，出现大量的絮体污泥，说明新一代微生物已经开始生长繁殖，出水水质变好，预示着污泥活性开始恢复。紧接着通过缩短沉降时间来截留具有活性的污泥，致使MLSS降低。第35天开始，颗粒污泥结构稳定，去除率高，微生物量丰富，已经完全恢复了好氧颗粒污泥的良好性质，标志着颗粒化完成。此后，第二代新生小颗粒污泥质量比逐渐提高，系统运行趋于稳定。

2.2 活性恢复过程中污染物的去除效果

在污泥活性恢复过程中对污染物的去除效果如图3所示。

从图3（a）可知，进水COD为800~1400mg/L。恢复试验第2天，进、出水COD分别为1264.47、203.63mg/L，去除率为83.90%，达不到出水水质标准。第6天时，去除率约为90%。后期即使进水COD上下波动明显，去除率仍然保持在90%以上，最高达98.7%，平均在95%，达到了冷冻储存前的COD去除效果。说明好氧硝化细菌活性良好，已经完全恢复了AGS的除污特性。絮状污泥与颗粒污泥共存的两相污泥没有降低COD去除率。

从图3（b）可知，进水NH4+-N为42.12~62.46mg/L，出水水质波动较大。第2~7天，出水NH4+-N平均为34.61mg/L，去除率只有34.67%，活性恢复才刚开始。随后两周，NH4+-N去除率持续上升。到第20~35天，出水NH4+-N平均浓度降到9.41mg/L，最低为3.11mg/L，去除率提高到80%以上，最高达到93%。但因为此时颗粒污泥的结构并不完整，多为扁平状，破坏了AGS的好氧-兼氧-厌氧空间结构，缺乏厌氧菌，致使反硝化反应不彻底。第35天后，颗粒结构重新稳定，空洞部分形成了厌氧区，NH4+-N去除效果变好。到了第60天后，缩短沉降时间至5min，大量污泥从系统流失。同时，此时进入冬季，水温在10~15℃之间，微生物活性受到抑制，絮状污泥生长缓慢，颗粒污泥减少，使得NH4+-N去除效能下降。随后为提高MLSS，沉降时间调至25min，第90天之后，颗粒污泥逐渐恢复，稳定后NH4+-N去除率在82%左右，但依旧不能恢复到90%以上，主要是受温度的影响。

从图3（c）可以看出，进水PO43--P浓度约为11mg/L，出水PO43--P浓度最低为0.87mg/L，整体变化趋势与NH4+-N相似。波动起伏后，去除率最终在第105天恢复到80%以上。

2.3 微生物群落高通量宏基因组测序分析

AGS内部存在厌氧、兼氧、好氧复杂的空间结构，不同的区域能够为各功能微生物提供适宜的生存条件。在硝化细菌、反硝化细菌及异养菌共同作用下，可以实现同步脱氮除磷。因此，分析AGS的微生物群落、优势菌群有助于探究AGS活性恢复机理。为此，在研究冷冻颗粒污泥物理活性恢复和污染物去除效能的基础上，通过高通量宏基因组测序手段，对活性恢复第65、90、120天的AGS样品的16SrDNA的V3-V4进行扩增，从而获得有效序列。

2.3.1 微生物的多样性

使用相似性97%的操作分类单元（OTUs），利用Mothur软件进行稀释性分析，微生物稀释曲线如图4所示。曲线光滑平整，说明检测到的微生物信息量大且稳定，4个样品的曲线都趋于平坦，表明测序结果涵盖了样品中绝大多数微生物信息。

图5为微生物群落的Venn图。

从图5可知，4个样品的总OTUs数为13260个，共同重叠的为220个，占OTUs总数的1.66%，表明伴随着颗粒化过程，微生物群落组成发生了较大改变且存在一定的相似性。

当达到饱和测序时，所获得的物种最大数量由Chao1指数表征。颗粒污泥形成过程中，Chao1指数的排序为D1>D4>D3>D2，见表1，表明样品丰富度不断发生变化。D1时期物种丰富度较高，D2、D3阶段物种丰富度降低，D4阶段又得到恢复。

2.3.2 微生物群落在门水平上的差异

不同时期污泥样品细菌在门水平上的分布情况如图6所示。可知，在4个检测样本（D1~D4）中，细菌在门水平上分类数目分别为14、13、16、14。从4个样品的检测结果来看，无论在哪个阶段，变形菌门（Proteobacteria）都占到细菌门类总数60%以上，拟杆菌门（Bacteroidetes）在各个阶段的占比均在20%以上，可见Proteobacteria和Bacteroidetes为主要门类，对降解番茄酱生产废水起着重要作用，这与陈启伟等的结果一致。Proteobacteria由于涵盖的菌株丰富和代谢途径的多样性，作为优势门类在各种废水生物处理系统中也被报道，如焦化废水、宠物食品工业废水、制药和炼油厂废水等。同一时期不同粒径的污泥因其结构不同，微生物群落存在差异。D3、D4为同一时期不同粒径的污泥样本，两样本间的微生物存在细微差异。较明显的是绿弯菌门（Chloroflexi）在D3时期出现（占0.02%），然而在D4中又消失不见，说明此菌门存在于120d时的小粒径（0.45~2mm）污泥中。另外，厚壁菌门（Firmicutes）在D3中的含量为0.11%，在D4中的含量为0.52%。

从图6还可以看出，污泥中的微生物菌群也发生着变化。疣微菌门（Verrucomicrobia）从D1时期的1.49%上升到D3时期的3.09%，Firmicutes由4.3%降到了0.11%。同时期装甲菌门（Armatimonadetes）的变化也较大，由0.68%下降到0.03%。在此期间，污泥浓度也是在不断变化的，Verrucomicrobia的增多是由于污泥浓度增大引起的。同时，系统对NH4+-N和PO43--P的去除率也在逐渐升高，这说明Firmicutes和Armatimonadetes的减少对NH4+-N和PO43--P的去除有一定的积极作用，这是微生物群落演替的结果。

值得一提的是，浮霉菌门（Planctomycetes）的占比在D1~D4时期持续上升。而Planctomycetes的浮霉菌属（Planctomyces）和小梨形菌属（Pirellula）等都属于专性好氧菌。与此同时，在Planctomycetes中还存在一类和Planctomyces等关系较远的细菌，由于暂时无法分离获得纯菌株，因此尚未能正式命名和分类（如CandidatusKuenenia、CandidatusScalindua、CandidatusBrocadia属），它们能够利用亚硝酸盐在缺氧环境下氧化铵离子生成氮气来获得能量，因此称作厌氧氨氧化菌。在该过程中，对NH4+-N的去除效果变好，说明该种菌对废水中NH4+-N的去除做出了贡献。这也显示，该类细菌的富集将有助于短程硝化反硝化过程，对水生态环境的氮循环及番茄酱加工废水的高效降解具有重要意义。

2.3.3 微生物群落在目水平上的差异

各样品细菌在目水平上的分布情况如图7所示。可以看出，红环菌目（Rhodocyclales）、鞘脂杆菌目（Sphingobacteriales）为主要菌目，两菌目占比之和约为50%。伯克霍尔德氏菌目（Burkholderiales）、黄杆菌目（Flavobacteriales）和嗜甲基菌目（Methylophilales）的变化较大。Burkholderiales在D3时期数量最多，而D3时期系统絮体污泥的占比较小，说明Burkholderiales在颗粒污泥中的量要多于在絮体污泥中的，这与已报道的Burkholderiales为番茄酱废水的主要降解菌结论一致。Flavobacteriales的分布情况与Burkholderiales相反，其在D2中的占比要大于在D1和D3中的，更容易存在于絮体污泥中。Methylophilales的分布情况与Burkholderiales类似，其在颗粒污泥中的占比大于在絮体污泥中的。

从图7还可以看出，一些细菌在生长过程中被淘汰了，同时伴随一部分新的菌目出现。如梭菌目（Clostridiales）存在于D1和D2样品中，而在D3样品中消失。再如红细菌目（Rhodobacterales）在D1与D2中的数量明显高于在D3与D4中的。可见，不同时期不同菌群表现出的协同或者竞争关系，即微生物群落的演替是活性污泥微生物有效降解有机物的驱动力，对反应体系的稳定性具有重要作用。

3、结论

①恢复初期颗粒污泥最大膨胀到11mm并出现破裂解体现象，13d后颗粒污泥开始稳定恢复活性，到第20天时，部分存在空洞，出水水质变清澈，逐渐恢复了AGS性能。第35天以后，空洞的颗粒污泥解体、消失，密实的椭球污泥形成，已经完全恢复了AGS的良好性质，标志着颗粒化完成。最终，第130天时，0.45~4mm的粒径占比超过75%，占主导地位，MLSS稳定在8000mg/L左右。

②恢复再生后的颗粒污泥对COD、NH4+-N和PO43--P的平均去除率分别在95%、82%和80%以上。高通量测序结果显示，不同时期菌群的多样性不断变化，物种的均匀性逐渐上升。在门水平上，变形菌门和拟杆菌门之和占到总污泥菌群80%以上，是优势菌群。浮霉菌门的占比在D1~D4时期持续上升，它的属中有一类细菌称作厌氧氨氧化菌，对氮循环及番茄酱加工废水的高效降解具有重要意义。在目水平上差异明显，红环菌目和鞘脂杆菌目是处理番茄酱废水的主要菌目。伯克霍尔德氏菌目在颗粒污泥中的分布要多于絮体污泥，也是番茄酱废水的主要降解菌。