厌氧氨氧化(anaerobicammoniumoxidation,Anammox)与传统脱氮技术相比有许多优点，如能耗低、污泥产量较少且无需外加碳源，常被用于处理高氨氮废水。但Anammox过程会产生一定量的硝酸盐，限制脱氮效果进一步提高。工业废水，如焦化、石化、印染等，成分复杂毒性大，难以处理。这类工业废水不仅含有NH4+-N，还存在甲酚、苯酚等有毒有机污染物。酚类化合物虽对细菌活性有一定的抑制作用，但可以作为电子供体用于反硝化反应。若能将2种工艺耦合，则可将氮素和有机物同步去除。周少奇等研究发现，Anammox反应产生的NO3−-N，可用于反硝化反应；而反硝化过程消耗有机物，从而减弱有机物对Anammox菌的抑制，理论上两者可实现协同作用。近年来不少学者探究了苯酚对Anammox系列工艺的影响，LUO等将苯酚投加到Anammox系统中探究其抑制机制，结果表明，苯酚(0~300mg·L−1)对Anammox无显著抑制作用，且苯酚激活了反硝化作用，总氮去除负荷(nitrogenremovalrate,NRR)提高了0.94kg·(m3·d)−1。而陈璇等在苯酚对Anammox颗粒污泥脱氮性能抑制作用的研究中发现：当苯酚浓度为50和150mg·L−1时，NH4+-N去除率分别降低了15.05%和24.35%。在Anammox系列工艺处理含酚废水方面，一些学者也得到了不同的结果。WANG等采用分离式短程硝化-厌氧氨氧化工艺处理含酚废水，在NH4+-N浓度为200mg·L−1、苯酚/NH4+-N质量比为0.5的条件下，COD去除率为92%，苯酚去除率达100%，总氮去除率(nitrogenremovalefficiency,NRE)为82.4%。而HE等采用含有苯酚和氨氮的废水(氨氮150mg·L−1、苯酚50mg·L−1)，成功启动单级短程硝化/厌氧氨氧化反应器，总氮和COD去除率仅为73.0%和79.5%左右。

颗粒污泥作为固定化微生物聚合体，具有结构致密、沉降性能好，对不利环境抵抗能力强等突出优势。而胞外聚合物(extracellularpolymericsubstances,EPS)是污泥的重要组成部分，很多特性都显著影响污泥性能。ZHOU等通过接种絮状及细小颗粒状的Anammox污泥启动厌氧氨氧化耦合异养反硝化(simultaneousanammoxanddenitrification,SAD)工艺，发现随着负荷增大，污泥EPS增多粒径增大，颗粒化逐渐明显。LI等发现适量的有机碳源(<130mg·L−1)可提高Anammox颗粒污泥的EPS含量，从而提高污泥的沉降性能。LUO等在探究苯酚对Anammox工艺的影响时发现，随着苯酚质量浓度从0增加到200mg·L−1，EPS含量从(251.50±13.88)mg·g−1逐渐增加到(411.10±11.64)mg·g−1，其中蛋白质(protein,PN)含量多且增幅大。EPS中PN和多糖(polysaccharide,PS)两大组分在Anammox颗粒污泥的形成、运行中发挥重要作用，在不同反应器类型及氮负荷条件下，颗粒污泥的EPS含量与PN/PS存在显著差异。

可见，在以往的研究中认为基于Anammox工艺并耦合硝化、反硝化等工艺处理含酚废水是可行的，而以Anammox工艺为基础，通过添加有机物为碳源启动SAD工艺相对比较简单快捷；但由于含酚废水的有毒性、难降解性，采用该工艺处理含酚废水鲜有报道；此外，有关酚类物质对污泥中EPS的成分、结构及其对颗粒污泥特性的影响尚无统一认识。鉴于此，本研究以实验室已经启动的Anammox系统为基础，通过添加有机物及苯酚，探究SAD工艺启动过程的脱氮除碳性能及污泥特性，以期为该耦合系统的稳定运行提供理论依据，这对该工艺的推广运用以及处理含酚废水具有重要指导意义。

1、材料与方法

1.1 实验装置与流程

本实验采用升流式厌氧污泥床(upflowanaerobicsludgebed,UASB)装置，其工艺流程如图1所示。反应器有效容积10L，外层设有水浴夹层，最外层包裹橡塑保温材料，使温度保持在(33±2)℃。反应器设有内循环，回流比控制在32.0%~48.0%；采用连续进水，水力停留时间(hydraulicretentiontime,HRT)为6.15h，上升流速为3.62m·h−1。

1.2 接种污泥

基于课题组前期稳定运行2个月的厌氧氨氧化UASB反应器，反应器内Anammox颗粒污泥量为1L，污泥质量浓度(mixedliquorsuspendedsolids,MLSS)为3462mg·L−1，MLVSS/MLSS比为0.46。

1.3 实验运行条件

SAD工艺启动共历经6个阶段。维持溶解氧(dissolvedoxygen,DO)在0.01~0.8mg·L−1左右，进水pH为7.8左右。采用NH4Cl和NaNO2模拟废水，乙酸钠和苯酚的COD当量值分别以0.78和2.383计算，具体运行条件由表1所示。

1.4 分析方法

1)水质及污泥性质分析。

COD、NH4+-N、NO2−-N、NO3−-N、MLSS和MLVSS均按《水和废水监测分析方法》(第4版)进行测定，选用紫光分光光度法测定苯酚浓度：取不同浓度苯酚的标准样品10mL分别置于25mL比色管中，加入1mL，pH为9.4硼酸-氯化钾-氢氧化钠缓冲液混匀，加入0.2mL，0.5%的2,6-二溴苯醌-4-氯亚胺乙醇液，摇匀放置20min，在600nm处测量吸光值，得到苯酚浓度与吸光度的标准曲线，将未知样品吸光度值带入标准曲线求得苯酚浓度。溶解性微生物产物(solublemicrobialproduction,SMP)和EPS采用热处理法萃取：取50mL泥水混合物放入离心管中，在6000r·min−1下离心15min，上清液过滤后即为SMP，向离心管中加入与上清液等体积的质量分数为0.9%的NaCl溶液，摇匀后沸水浴1h，在6000r·min−1下离心15min，取上清液过滤即为EPS。其中SMP和EPS中PN采用考马斯亮蓝法测定，PS采用苯酚-硫酸法测定。粒径分布采用筛分法。颗粒污泥采集：在各阶段末期从1~5号及底部取样口取等体积的泥水混合物，然后混合均匀。

2)脱氮贡献率计算。

由于TN去除是Anammox和异养反硝化耦合作用的结果，其中NH4+-N去除是Anammox作用完成的，而NO3−-N去除是反硝化作用的结果。根据Anammox反应化学计量比(式(1))以及式(2)~式(6)计算，可推测Anammox和反硝化对TN去除的贡献率。

式中：C1为NH4+-N去除量，mg·L−1；C2为NO2−-N去除量，mg·L−1；C3为NO3−-N生成量，mg·L−1；E1为Anammox反应脱氮贡献率，%；E2为反硝化反应脱氮贡献率，%。

3)三维荧光光谱(three-dimensionalexcitationemissionmatrixfluorescencespectroscopy,3D-EEM)分析。

取各阶段末颗粒污泥萃取得到的SMP和EPS提取液，通过三维荧光光谱仪(日立F7100,日本)进行测定，激发波长(Ex)和发射波长(Em)200~550nm，间隔均为5nm，扫描速度为60000nm·min−1，结果数据采用Origin2021进行处理与分析。

4)傅里叶变换红外(fouriertransforminfraredspectrometer,FT-IR)光谱分析。

取各阶段末期反应器中的颗粒污泥，用去离子水冲洗3次后，在105℃下烘干后与KBr按1∶180压片，采用傅里叶变换红外光谱仪(IRAffinity-1S,日本岛津公司)进行测定，结果数据采用Origin2021进行处理与分析。利用傅里叶自去卷积法对红外光谱酰胺Ⅰ区(1600~1700cm–1)进行处理，并利用PeakFit计算二阶导数谱和曲线拟合。

2、结果与讨论

2.1 UASB-SAD工艺启动过程中脱氮除碳性能

如图2所示，根据进水COD及其中苯酚含量的变化，将SAD系统启动过程分为6个运行阶段。阶段Ⅰ为Anammox的适应期，运行7d后出水稳定，NH4+-N、NO2−-N的去除率分别为95.07%、97.45%，总氮容积负荷(nitrogenloadingrate,NLR)和NRR分别为0.853kg·(m3·d)−1和0.71kg·(m3·d)−1，NRE为83.72%。C2/C1和C3/C1比值分别为1.34和0.26，符合厌氧氨氧化反应的特征理论值。

在阶段Ⅱ，开始投加有机物，出水NH4+-N为8.40mg·L−1，去除率比上一阶段下降了3.60%，说明投加有机物对Anammox产生抑制作用；但由于反应器内培养出反硝化菌，因此，NRE有一定的提升，在NLR基本不变的条件下，NRE可达90.74%，NRR为0.78kg·(m3·d)−1。相似地，LI等在探究COD对Anammox工艺的影响时，发现当COD为100mg·L−1时，NH4+-N和TN的去除率均达到90%以上。系统内有机物得到同步去除，COD去除率为88.58%，碳去除负荷(carbonremovalrate,CRR)达到0.32kg·(m3·d)−1。阶段Ⅲ~Ⅵ，在保持COD不变的情况下，逐渐将乙酸钠替换为苯酚。其中阶段Ⅲ和阶段Ⅳ，由于苯酚质量浓度还处于较低水平(分别为10、20mg·L−1)，对耦合系统的影响较小；2个阶段共运行26d后，出水稳定，出水水质与阶段Ⅱ相比无明显变化。在阶段Ⅳ末期，出水苯酚为2.45mg·L−1，去除率达88.19%，表明耦合系统对苯酚有一定的耐受性，且能够高效稳定地处理低浓度含酚废水。在阶段Ⅴ，随着苯第1期王朝朝等：含酚废水SAD工艺的启动及污泥特性93酚质量浓度提高对Anammox菌的抑制作用加强，NH4+-N去除率下降为84.92%，TN去除率为87.31%。而C3/C1比值为-0.027，即出水NO3−-N浓度低于进水，表明反硝化作用进一步加强。此阶段COD和苯酚去除率也有所下降，分别为86.92%和85.98%。阶段Ⅵ，进水有机物全部为苯酚，经过25d运行后，反应器出水稳定；出水NH4+-N、NO2−-N分别为16.41mg·L−1和12.33mg·L−1，相较于阶段Ⅱ中完全以乙酸钠为碳源，其去除率分别下降了10.92%和3.87%；TN和COD及苯酚去除率分别为84.78%、85.23%、84.09%，NRR和CRR为0.73kg·(m3·d)−1和0.31kg·(m3·d)−1。冀颖等以乙酸钠为碳源启动SAD工艺，在C/N比为0.5条件下，NRR可达1.75kg·(m3·d)−1，NRE为90.81%，而COD去除率仅79.19%。他们的实验结果与本文差别较大，可能是由于乙酸钠和苯酚对Anammox菌活性抑制强度不同，及反应器运行条件有差别引起的。

综合来看，在各阶段苯酚浓度提高后，出水水质波动较大，这是由于有机物及苯酚对Anammox菌有一定的抑制作用，导致功能菌活性下降；但由于本实验接种污泥为Anammox颗粒污泥，其结构紧凑抗冲击能力高，可以维持一个相对稳定的微环境，使得颗粒污泥内微生物较快适应复杂环境条件，因此碳、氮去除率很快就恢复至较高水平。先以乙酸钠为碳源再逐步替换为苯酚，对微生物来说各阶段过渡时外界环境变化较小，有利于驯化细菌，逐渐提高对苯酚的耐受性。

2.2 脱氮贡献率分析

对Anammox和反硝化对TN去除的贡献率分析结果如图3所示。可见，随着苯酚浓度升高，Anammox对TN去除的贡献率由97.92%降低到81.66%，而反硝化对TN去除的贡献率由2.08%上升到18.34%，说明在耦合系统中苯酚对Anammox菌的抑制作用更强。王猛等在探究石油炼化废水中COD和毒性物质对厌氧氨氧化-反硝化细菌混培物的影响时，也同样发现Anammox菌比反硝化细菌对石油炼化废水的毒性作用更敏感。这是因为对于反硝化细菌来说，由于反应可以利用多种代谢途径获取能量，所以基质对细菌的影响相对较小，且反硝化菌的繁殖速度远超过Anammox菌。从各阶段2种细菌对TN去除率的贡献来看，Anammox贡献率始终>80%，且NH4+-N、NO2−-N的去除主要是由Anammox来完成的。因此，要保证耦合系统稳定运行，关键是保障Anammox菌的活性。

2.3 UASB-SAD工艺启动过程中污泥特性

1)污泥表观形态、污泥粒径的变化。

如图4所示，在阶段Ⅰ，颗粒污泥主要为黑红色和红棕色。从阶段Ⅲ起，在粒径较大的颗粒污泥表面可以观察到大量白色点块，这是因为反硝化菌在颗粒污泥表面大量增殖。到阶段Ⅵ，黑红色颗粒污泥减少红棕色污泥增多，整体颜色由深变浅。SAD启动成功时，得到的污泥主要是一种Anammox菌外面包裹反硝化菌的颗粒污泥，以及少量的白色反硝化菌絮状物。刘常敬等启动SAD工艺得到的污泥形态呈颗粒状，有Anammox颗粒污泥、苯酚反硝化颗粒污泥、Anammox菌外面包裹苯酚反硝化菌的颗粒污泥3种形式。这与本研究结果略有不同，主要归因于进水苯酚浓度不同，氮负荷以及污泥浓度差别较大。

在SAD启动过程中，粒径处于1.5~2.0mm的颗粒污泥占比始终最大。由图5可见，从阶段Ⅰ到阶段Ⅱ，污泥粒径有所下降，2.5mm的颗粒污泥占比逐渐增大。随着苯酚浓度的增加，颗粒污泥粒径呈现增大的趋势，这与之前的一些研究结果不同，CHEN等在评估有机物对Anammox颗粒污泥的影响时，发现COD为200mg·L−1实验组颗粒污泥的机械强度和沉降性能降低，部分颗粒污泥解体。而刘常敬等以苯酚为碳源启动SAD工艺得到的颗粒污泥直径达3mm。这归因于运行方式不同。本文采用逐步提高苯酚浓度的方式，系统内微生物有适应的过程，且COD及苯酚浓度较低，微生物为了保护自己不受低浓度有机碳源的影响，会分泌更多的EPS，使厌氧氨氧化颗粒污泥更容易粘附和聚集，导致粒径显著增大。

2)SMP与EPS的变化。

各阶段的SMP和EPS含量及组成如图6所示。可见，SMP含量由11.03mg·g−1增加到33.97mg·g−1，其中在阶段Ⅰ~Ⅲ，进水苯酚浓度较低，对颗粒污泥影响较小，SMP含量无明显变化；EPS含量始终大于SMP，且随着苯酚浓度升高，呈现增多的趋势，阶段Ⅰ为20.57mg·g−1，到阶段阶Ⅵ增至58.84mg·g−1。这主要是因为在外部环境发生突变时，细菌为了确保自身生存，会产生大量的EPS，而EPS会在细胞间形成交联网络，避免颗粒污泥解体且强化完整性，从而避免毒性有害物质与细胞直接接触，减少对细菌的损害。在SMP和EPS中，PS含量少且无显著变化，而PN含量多且增幅大，表明PN是SMP和EPS的主要成分。与阶段Ⅰ相比，投加有机物后SMP中PN/PS值有显著提高，由5.73上升至12.32，而EPS中PN/PS值由8.29上升至13.94。在阶段Ⅲ(苯酚20mg·L−1)之前SMP、EPS及其PN/PS增幅均较小，推测与苯酚浓度有关，刘常敬等认为当苯酚浓度为18.8mg·L−1时，Anammox与反硝化耦合效果最好。PN含量的增加及PN/PS的增高使污泥疏水性增加，从而使微生物细胞更易于从水相中脱离出来，其受水中苯酚毒性的抑制作用也将得到有效缓解。

2.4 颗粒污泥3D-EEM分析

各阶段颗粒污泥中SMP和EPS的3D-EEM图谱如图7所示。在SMP的EEM图谱中存在2种特征荧光峰A和B，对应的Ex/Em分别在280nm/330nm、230nm/330nm，其中，A峰为色氨酸类蛋白质物质，B峰为酪氨酸蛋白类物质。EPS与SMP的EEM图谱相似，同样存在2个荧光峰A和B，荧光峰位置与SMP的EEM图谱有略微区别，分别位于Ex/Em=275nm/320~350nm、Ex/Em=220~230nm/330nm。这主要是因为，EPS中峰A和峰B的荧光强度和峰面积远大于SMP。随着苯酚浓度的增大，Anammox菌和反硝化菌在受到毒性刺激，会释放更多分泌物，从而维持污泥形态和性状，这也是导致A、B峰强度提升的主要原因。在SMP和EPS的EEM图谱中均出现了色氨酸蛋白类荧光峰与酪氨酸蛋白类荧光峰，且随着苯酚浓度升高其对应的荧光峰强度增大，说明这2类物质在SMP和EPS中含量较多，可能在抵抗苯酚毒性及保持颗粒污泥完整起到了重要作用。ZHU等通过比较絮凝体和颗粒污泥中EPS的成分，发现芳香族蛋白物质和色氨酸类物质是颗粒污泥中EPS的关键成分，在维持颗粒污泥结构稳定发挥了重要作用。

2.5 颗粒污泥的FT-IR及其蛋白质二级结构分析

如图8所示，各阶段颗粒污泥的红外图谱相似。在3456cm–1处有一强吸收峰，主要是由蛋白质类和多糖类物质N—H和O—H伸缩振动引起；在2927cm–1处存在1个较弱的吸收峰，为脂肪类有机物中C—H反称伸缩振动所致；2365cm–1处吸收峰可能由CO2引起。1645cm–1处的强烈吸收带是由蛋白质酰胺I区的C＝O和C＝C拉伸振动引起的，1382cm–1处峰与酰胺Ⅱ区O—C—O对称拉伸有关；1275cm–1附近的吸收峰是由蛋白质酰胺Ⅲ区C—N伸缩振动引起的。1081cm–1处的吸收峰主要与C—O—C伸展振动有关，是多糖物质的特征峰。值得关注的是，随着苯酚浓度增大，1275cm–1和1081cm–1处的波峰强度变化不明显，而在1645cm–1和1382cm–1处的波峰强度逐渐增大，表明蛋白质酰胺I区的C＝O和C＝C伸缩振动、酰胺Ⅱ区的O—C—O对称拉伸峰有所增强，这种变化与SMP、EPS中PN的含量变化相一致。FT-IR分析结果进一步证实了EPS中PN含量的增加是颗粒污泥稳定的关键因素。

蛋白质二级结构的相对含量与其亲/疏水性密切相关，并对污泥的吸附和聚集能力有重要影响，在蛋白质二级结构的研究中，常使用红外光谱酰胺I区域作为研究对象，分析结果如图9所示。表2呈现了4种主要蛋白质二级结构的相对含量。可见，随着苯酚浓度的升高，颗粒污泥EPS中蛋白质二级结构的相对含量发生了变化，其中β-折叠和无规则卷曲的占比逐渐增大。通常用α-螺旋/(β-折叠+无规则卷曲)比值来评估蛋白质的亲疏水性。杨明明等发现蛋白质二级结构α-螺旋/(β-折叠+无规则卷曲)比值由0.60逐渐降低到0.43，污泥表面疏水性由54.2%提高到63.1%。在本研究中，各阶段颗粒污泥的α-螺旋/(β-折叠+无规则卷曲)比值从0.498逐渐下降到0.415，进一步证实颗粒污泥蛋白质疏水性升高。

3、结论

1)在苯酚质量浓度为37.77mg·L−1，平均NLR为0.85kg·(m3·d)−1的条件下，UASB-SAD反应器能长期稳定运行，且对TN和苯酚有较高的去除率，分别为84.78%和84.09%；Anammox在耦合系统中起主导作用，对NRE的贡献率始终大于80%。

2)启动过程中主要形成一种在Anammox菌外面包裹反硝化菌的颗粒污泥，污泥粒径增大；SMP和EPS中PN含量多且增幅大，PN/PS比值增大，颗粒污泥疏水性增强。

3)FT-IR和蛋白质二级结构分析进一步表明，PN含量的增加是污泥疏水性增大的关键因素；3DEEM分析结果表明，色氨酸和酪氨酸类物质是颗粒污泥中SMP、EPS的关键成分，在抵抗苯酚毒性时发挥了重要作用。